Si trova in via Etnea e copre una superficie di sedicimila metri quadrati. Fu costruito intorno al 1850 ad opera del monaco Benedettino Francesco Tornabene, che affidò il progetto a Mario Di Stefano.
Il complesso architettonico, come quello palermitano, è in stile neoclassico. Superato l'ingresso, in fondo al grande viale, si trova l'edificio principale, preceduto da una gradinata marmorea e da un portico con doppia fila di colonne. Il soffitto è a cassettoni, con rosoni di stucco. Al centro dell'Orto è posto l'Erbario, un piccolo edificio neoclassico. Nella seconda guerra mondiale il complesso architettonico fu bombardato e perse la serra voluta da Tornabene, detta Tepidario; di essa rimane solo una traccia nel terrapieno occupato dalle succulente. L'Orto è diviso in hortus generalis, che raccoglie soprattutto piante esotiche, e hortus siculus. L'hortus generalis è composto da quadrati delimitati da gradini in pietra calcarea.
Una delle due piccole serre ospita la collezione del dottor Gasperini, cultore di piante grasse, che nel 1982 ne fece dono all'Orto Botanico. Una terza serra caldo-umida è utilizzata per la riproduzione di palme e la coltivazione di piante esotiche. Tre vasche circolari per la coltivazione di piante acquatiche concludono questa parte. L'orto siculo è invece ripartito in aree rettangolari molto strette, delimitate da cordoni in pietra lavica e nelle quali le piante sono disposte per famiglia. L'Erbario è una struttura museale dedicata in modo specifico alla raccolta ed alla conservazione delle piante essiccate. Attualmente ospita collezioni di notevole importanza storica e raccolte recenti (150.000 fogli d'erbario).