L'interminabile dominio spagnolo - che inizia nel 1516 con Carlo V, prosegue con i lunghi regni di Filippo II, Filippo III, Filippo IV e si conclude con Carlo II, morto senza eredi - degrada per sempre a viceregno una Sicilia "sequestrata" e "sfruttata", ridotta al ruolo di provincia del vasto impero spagnolo (che, dalla scoperta dell'America del 1492, comprende anche il Nuovo Mondo); depredata dai continui ed esosi "donativi" (impiegati per la politica di conquista dell'Africa e di predominio in Italia ed Europa); dominata da una casta baronale incapace di esprimere un proprio ruolo politico, ma solo dedita al fasto ed all'etichetta della corte palermitana, ove sperpera le ricchezze accumulate nei feudi; assediata (fino alla vittoria di Lepanto del 1571) dai Turchi, che depredano continuamente le coste (per cui le popolazioni costiere si rifugiano all'interno, dove si ha, come a Nicosia, un aumento di popolazione); sconvolta da continue rivolte (popolari e non); terrorizzata dalla "santa" inquisizione (che ricorre anche al rogo); devastata da frequenti carestie, pestilenze e terremoti. Ed è proprio l'immane terremoto del 1693 in Val di Noto a chiudere emblematicamente il lungo dominio spagnolo in una Sicilia più delusa che rassegnata. Il 1500 si apre a Nicosia su scenari constrastanti: da un lato la presenza dell'arte delicata di Antonello Gagini (che nel 1511 consegna la monumentale "cona" di S. Maria, e che, assieme ad allievi suoi, continuerà ad essere fortemente richiesto); dall'altro la ripresa delle rivalità religiose tra le due chiese di S. Maria e S. Nicolò (scatenatesi nel 1514 per un banale diritto di precedenza in una processione); infine la visita effettuata da Carlo V nel 1535 (che, di ritorno da Tunisi, visitando la Sicilia, soggiorna a Nicosia nel palazzo La Via, forse quello di via S. Benedetto). La visita di Carlo V non sembra, però, galvanizzare al meglio l'ambiente nicosiano, dilaniato dalle molte rivalità. ll Consiglio è diviso dai contrasti tra i nobili ed i populares. Questi ultimi, sostenuti da alcuni baroni, dai ministrales (ecclesiastici) e dagli artigiani, nel 1530 danno luogo ad una manifestazione di protesta per chiedere una paga più alta. La classe dei nobili reagisce e riesce ad ottenere l'estromissione degli artigiani dal Consiglio (il cui numero viene ridotto a 40). Tuttavia, nel 1540 viene eletto sindaco fra' Cola dei Minori Osservanti, che, durante il suo breve periodo, promuove coraggiose innovazioni sociali. Ma il tentativo è di breve durata: i nobili riprendono il sopravvento e le istituzioni demaniali si chiudono ad ogni ulteriore istanza di rinnovamento. La ricchezza prodotta viene sperperata, oltre che dai più gravosi "donativi" che Nicosia è costretta a pagare (per cui si trova "aggravata da multi ed infiniti debiti", come registra opportunamente il Liber Gratiarum), anche dalle già ricordate rivalità religiose che, dal 1514, riprendono con grande furore ed animosità. Queste si susseguono, ostinate e violente, per tutto il secolo e vanno dai litigi in pubblico fra il clero delle due chiese (il più animoso è quello di S. Maria, che arriva perfino ad aggredire con le armi delle croci sacre quello di S. Nicolò e ad usurpare gli stalli di quest'ultimo nel coro) alle numerose cause promosse presso i tribunali ecclesiastici e civili. Dopo vari tentativi di conciliazione si ha, nel 1589, il lodo di Orosco, così detto da Mons. Orosco vescovo di Siracusa, che emise la sentenza arbitrale, con il qualei si riconosce il titolo di Matrice alle due chiese rivali e l'alternanza annuale delle funzioni del matriciato. Nel 1575 arriva la prima pestilenza, che non sembra mietere molte vittime e che, secondo leggenda, sarebbe cessata per intercessione di S. Luca Casale. Nicosia, tuttavia, nella seconda metà del 1500, risulta in piena espansione demografica e passa dai 10.000 abitanti del 1548 ai 16.744 del 1570 ed ai 21.181 del 1583 (questi sono i dati riportati nelle varie Numerazioni dei fuochi e delle anime, come a dire i censimenti di quei tempi). Ed è così che, fino alla pestilenza del 1591, si ha un piccolo "rinascimento": Marcello Capra, autore di trattati filosofici e medici, al ritorno dall'Università di Padova fonda un'accademia medico-filosofica che si riunisce a S. Nicolò; un'accademia di matematica e musica si riconosce in Pietro Vinci (1525-1584), grande madrigalista attivo, divenuto famoso in tutta Europa. La presenza dell'arte di Antonello Gagini e dei suoi allievi (Mancino, Vanello, Berrettaro) assicura anche a Nicosia la conoscenza dell'arte "rinascimentale" siciliana. Ma la pestilenza del 1591/92 (descritta da Marcello Capra, già trasferitosi a Messina), il clima d'intolleranza religiosa e l'atmosfera della "santa" inquisizione (che miete tra le sue vittime fra' Cornelio Chianciardo ed altri religiosi nicosiani) precludono ogni altro sviluppo. Anche il '600 è caratterizzato da stridenti contrasti. Da un lato è funestato da pestilenze, carestie e terremoti: la pestilenza del 1624 causa migliaia di vittime; la carestia provoca la rivolta popolare del 1647, che viene comunque sedata (e per questo ai giurati viene conferito il titolo di Senato). Conseguentemente la popolazione subisce una notevole diminuzione e scende a 15.465 abitanti nel 1631 e poi a 11.000 circa a fine secolo. D'altro lato vi è una grande fioritura artistica con la presenza di una folta corporazione di scultori (i Li Volsi ed i Calamaro, padri e figli) e di pittori (Nicola Mirabella, Giacomo Campione, Antonio Cardella)  che dànno luogo ad una produzione (soprattutto scultura in legno e pittura su tela) di grande livello. Ed anche l'orgoglio municipale è alto: i nicosiani riscattano con 24.000 scudi lo status di città libera di cui erano stati privati in seguito all'infeudamento della città al duca Antonio Ruffo.